LABTOX: Protocolos

Una buena defensa contra cucarachas

2006-09-08T19:12:00.000-05:00

PROTOCOLO (RECETA) PARA ELIMINAR CUCARACHAS

Resulta que uno de mis amigos de toda la vida tiene un salón de fiestas y de tanto en tanto se le aparecen de la nada las cucarachas (aunque yo pienso que las atren las migajas de los deliciosos pastele y dulces que dejan por ahi tirados las niñas y los niños que acuden a las fiestas que ahí se organizan). Y oh sorpresa que han aparecido en diferentes ocacioines cucarachas (de esa chiquititas, pero que por ser chiquititas no dejan de molestarme - y es que despues de una guerra nuclera seguro que nos van a sobrevivir) en el edificio donde vivo. El caso es que aqui les dejo la receta que me dió:

Una lata de medio kilo de ácido bórico (se compra en las tlapalerías) puede eliminar a las cucrachas por mas de un año.

100 mg de azucar glas

Espolvoréalo en grietas, huecos, debajo de los fregaderoscerca de las instalaciones elctricas y en lugares oscuros

Aguarda a que paulatinamente desaparezcan (el mecanismo de acción lo desconozco pero ya lo averiguare).

Equipo de laboratorio II (Pipetas automaticas)

2006-09-03T20:12:00.000-05:00

Las utilísimas pipetas automáticas

Las indispensables Gilson (desde de mi punto vista son las mejores) de 20, 200 y 1000 uL

Las indispensables Eppendorff de 20, 200 y 1000 uL

La indispensable repipeteadora con jerenguillas de varias capacidades desde 10 uL hasta 500 uL.

La necesaria pipeta multicanal para ocho 8 ocho puntas de 50 y 200 uL para as placas de 96 pozos

La indispensable pipeta para volumenes de 1 a 25 mL (ya las hay con bateria reargable)

Equipo de laboratorio (el necesario)

2006-08-21T23:55:00.000-05:00

El equipo de laboratorio

Fuente de poder para camara de electroforesis vertical y camara de eletrotransferencia

Agitador mecanico (vortex)

Agitador orbital

Baño de maría

Baño seco

Determinación de proteinuria con ácido sulfosalicilico

2006-07-13T17:46:00.000-05:00

Determinación de proteínas (proteinuria) con Acido Sulfosalicilico

1]. Muestra: 0.5 mL de orina (lo mas fresca posible)
2]. Colocar 2.5 mL de ácido sulfosalicilico al 3% (Química Monterrey)
3]. Agitar suavemente
4]. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min
5]. Evaluar el grado de turbidez con respecto a una muestra que contenga agua destilada.
6]. A mayor turbidez, mayor cantidad de proteinuria. Se puede reportar en +, ++. +++. y ++++
7]. Si el resultado es positivo, repetir el ensayo utilizando procedimientos mas específicos.

Curva de calibracion

1). Usar tres o mas calibradores de proteínas diluidas en agua.

0, 100 ug/mL,
250 ug/mL,
500 ug/mL,
750 ug/mL y
1000 ug/mL de BSA (2 mg/mL)

2). Aforar 1 mL (1000 uL) con agua BD o buffer.

Nota: Esta medición se basa en la precipitación de proteínas y es muy reproducible

El acido sulfosalicilico es muy estable a temperatura ambiente (+ de 6 meses)

Determinación de la concentración de DNA o RNA

2006-07-11T09:42:00.000-05:00

Concentración de DNA por método espectrofotométrico en UV

Determinación de la concentración de DNA o RNA

1]. 495 uL de buffer (Buffer TE 1x) o de buffer para el "blanco"
2]. Leer a 260 y 280 nm UV
3]. 5 uL de muestra (Colocarla con una punta larga de las que se emplean para cargar geles) (Dilución final de 1/100).
4]. Mezclar bien y gentilmente (evitar las burbujas) con la misma pipeta
5]. Leer a 260 nm y 280 nm
6]. Calcular la concentración de ácidos nucleicos A260/A280

El valor de 1 en DO corresponde a aproximadamente:

= 50 ug/mL de DNA para DNA de doble cadena (ds DNA)
= 40 ug/mL de DNA para DNA de una sola cadena o de RNA
= 20 ug/mL para oligonucleotidos

Notas:

Las lecturas a 260 nm sirven para calcular la concentración de ácidos nucleicos

La razón de las lectras a 260 nm y 280 nm [A260/A280] permite estimar el grado de pureza de los ácidos nucleicos

Las preparaciones puras de DNA y RNA darán una razón de entre 1.8 y 2.0.

En el caso de contaminación con proteínas o fenol, l proporción será menor y no se podrá realiza la cuantificación adecuada.

ds DNA OD = 1 = > 50 ug/mL coeficiente de extinción molar = 1/50 = 0.02

La saliva como medio de diagnóstico (I)

2006-06-22T18:31:00.000-05:00

La saliva como medio de diagnóstico (I)

La saliva es un líquido claro que se fabrica en tu boca las 24 horas del día, todos los días. Está formada principalmente por agua y de varias sustancias químicas. Es producida por las glándulas salivales. Estas glándulas se encuentran en el interior de cada mejilla, en el fondo de la boca, y debajo de la mandíbula justo en la parte frontal de la boca. Estas producen alrededor de 1 a 2 litros/día de saliva.

La saliva es importante por muchas razones.
1.- Humedece los alimentos y hace que tragarlos sea más fácil.
2.- Ayuda a la lengua para permitir la degustacion de los sabores.
3.- Facilita el proceso de la digestión.
4.- Inhibe a caries y enjuaga los dientes para mantenerlos limpios. (pero no substituye al cepillado ni al hilo dental).
5.- Las enzimas de la saliva también ayudan a controlar la fauna bacteriana de la boca.
6.- Es un buen medio de diagnóstico.

Diagnóstico de los periodos de fertilidad en la mujer

Desde 1945, Papanicolau y cols. han estudiado y observado el fenómeno de cristalización salina en el moco cervical. En 1969, Biel Cassals, ginecólogo español, se avoco a la investigación con el tema de la cristalización de la saliva. Este médico investigador observó los cambios durante el período de menstruación de la mujer y la cristalización en la saliva. Indicó que los cambios durante el período de menstruación de la mujer y la cristalización en la saliva es muy semejante a la del moco cervical.

La progesterona y el estrógeno que, entre otras cosas, son las responsables de transformar la densidad del moco cervical y después de la ovulación, aparece la progesterona alterando los componentes de distintos fluidos corporales, con ello el moco cervical se hace menos flexible y en el microscopio de laboratorio, una vez cristalizado, se podrá observar como su estructura molecular cambia de forma radical y algo similar sucede con la saliva.

El período fértil oscila entre los 3-4 días antes y 1 día después de la ovulación. La ovulación (liberación del óvulo por el ovario) se produce una vez en cada ciclo menstrual. Tiene lugar aproximadamente 14 días antes del primer día de menstruación, pudiéndose producir en otro día si existen ciclos menstruales irregulares.

Procedimiento

1.- Colocar una gota de saliva recen emitida (la muestra se debar de obtener al medio día y con un ayuno de al menos tres horas, y sin cepillado ni enuage bucal durante ese mismo tiempo)
2.- Incubar a temperatura ambiente durante unos 5 a 10 minutos, o hasta que se seque completamente la saliva.
3.- Observar en el microscopio.

Interpretación de las imágenes

Helecho: Periodo muy fértil
Cristalización irregular, dispersa, sin forma: Periodo infertil.
Combinación de ambas: Posible perido de fertilidad

Nota: Ningún método es infalible, aunque si se realiza la prueba diariamente se ha demostrado que hay un muy bajo grado de error que alcanza un 3%-7%. Sin embargo, las fallas de interpretación de los resultados y el mal uso de la técnica, pueden aumentar considerablemente el error diagnóstico.

Determinación de creatinina

2006-05-17T20:04:00.000-05:00

Determinación de creatinina

1]. 5 uL de muestra (plasma desproteinizado, u orina)
2]. 45 uL de agua BD
3]. 50 uL de ácido pícrico 1%
4]. 50 uL de NaOH 10%
5]. Agitar suavemente
6]. Incubar a 22 oC, 3 min.
7]. Leer a 540 nm (también se puede leer a 492, 500, y 510 nm según se disponga de filtros en el lector de microplacas)
8]. La reacción es estable durante unos 30 min, después de ese tiempo se incrementa.

Curva de calibración

Creatinina (1 ug/uL): 0, 2, 4, 8, 15, 30, y 50 uL
Agua BD: 50, 48, 46, 42, 35, 20, y 0 uL
Ácido pícrico (1%): 50 uL a todos los pozos
NaOH (10%): 50 uL a todos los pozos
Volumen de muestra: 5, 10, o 15 uL

Preparacion de los reactivos:

Ácido pícrico 1%
1 g de ácido pícrico (Sigma).
Aforar a 100 mL con agua BD

NaOH 10%
10 g de NaOH (Química Monterrey, Monterrey Mex)
100 mL de HCL al 0.1 N (High Purity, Mexico, D.F)

Estandar de creatinina 1 mg/mL
0.1 g de creatinina (Sigma)
100 mL de HCL 0.1 N

2006-05-15T18:53:00.000-05:00

Zimografia (Gel de poliacrilamida copolimerizado con gelatina)

I. Muestra
Muestra (plasma, homgenado de tejido, liquido de dialisis, etc - 50 ug de proteina total

II. Gel de poliacrilamida co-polimerizado con gelatina
Gel Separador (8 mL, suficiente para dos geles de la camara miniprotean de BioRad)

2880 uL Agua bidestilada (BD, milliQ)
800 uL Gelatina 10 mg/mL (Sigma, USP, etc) (Conc. final: 1 mg gelatina/mL de gel)
2160 uL Acrilamida/bis al 30% (Amresco)
2160 uL Tris-Cl 1.5 M pH 8.8 (Amresco)
80 uL SDS al 10% (Sigma)
80 uL Persulfato de amonio al 10% (Amresco)
6 uL TEMED (Amresco)

Gel concentrador (2 mL, suficiente para dos geles de la camara miniprotean de BioRad)

1400 uL Agua BD
330 uL Acrilamida/bis al 30% (Amresco)
250 uL Tris-Cl 1.0 M pH 6.8 (Amresco)
20 uL SDS al 10% (Sigma)
20 uL Persulfato de amonio al 10% (Amresco)
4 uL TEMED (Amresco)

III. Preparacion de las muestras

Se utiliza la tercera parte del bufer de muestra con base en el volumen total de la muestra con proteinas.
Se mezclan en vortex y se incuban a temperatura ambiente durante 30 min (NO HERVIR)

IV. Bufer de muestra para MMP-9 4X (10 mL)

1 g SDS (conc final 2.5%)
0.8 g Sacarosa (Prod. Quim. Monterrey)
400 uL Sol. Rojo de Fenol al 1% (conc. final 0.01%)
10 mL agua BDV.

V. Corrimiento del gel

Aplicar las muestras (habitualmente entre 10 y 25 uL)
Correr el gel con 1X de Tris-glicina-SDS a 75 mV (por gel) a voltaje constante en frio (yo lo coloco dentro del refigerador en la parte mas baja y plana).
Tiempo de corrida: 1-2.5 horas.
SIEMPRE HAY QUE ESTAR VIGILANDO EL FRENTE DE COLORANTE.
La corrida se detiene cuando el rojo de fenol llega a borde inferior del gel y apenas se empieza a salir del mismo.

VI. Lavado de los geles para retirar el SDS

Solucion de renaturalizacion (lavado) (10x) Triton X-100 (Sigma), 25% (v/v) en agua BD

Los geles (por separado) se lavan en 30-50 mL de TritonX-100 al 2.5% durante 20-30 min en agitacion continua (agitador orbital) por tres veces consecutivas

VII. Bufer de revelado 500 mL (10x)

Parace mucho pero si se consume, antes de usarlo diluirlo a 1X

6.25 g Tris base
31.5 g Tris-HCl
58.5 g NaCl
3.7 g CaCl2
12.5 mL Triton X-100
0.2 g Azida de sodio (NaN3, Sigma)
500 mL Agua BD

Incubar en 50 mL (por cada gel) de esta solucion a 37 oC durante 12 h
El tiempo de incubacion puede variar mucho y se determiara empiricamente.
Al inico me salian grandes manchas y para corregir eso opte por incubar a 4 oC durante cuatro dias de esa forma se ven unas bandas bien definidas.
La mancha depende tambien de la cantidad de las colagenasas en las muestras.

VIII. Tincion de los geles

Teñir los geles con azul de Coomassie R-250 (Amresco) por 12 h.
Para mayor contraste se usa al 0.5% (w/v) en lugar de la cocenctracion de 0.1%.

Los geles se destiñen con solucion desteñidora que contiene

500 mL Metanol (High Purity de Mexico)
100 mL Ac. acetico (Prod. Quim. Monterrey)
400 mL Agua BD

Donde se encuentran las metaloproteasas aparecen bandas claras sobre un fondo azul marino, eso significa que se digirio la gelatina de esa zona.

Para los novatos y a veces no tanto

2006-03-15T20:02:00.000-06:00

Como preparar soluciones
Ver enlace: http://www.carolina.com/chemistry/resources/solution_preparation.asp

He aqui el texto:

How to make a solution:

The following "how to make a solution" is from CAROLINA

Remember: Always follow appropriate lab safety procedures when mixing and storing chemicals.
When a substance, called a solute, is dissolved in another substance, called the solvent, a solution is formed. A solution is a uniform distribution of solute in solvent. For example, vinegar is a solution of acetic acid, the solute, in water, the solvent. The amount of solute in a solvent is important and can be expressed in several different ways. Some common units of concentration will be discussed in this manual.

1.
Molar solutions

Molarity (M) means the number of moles of solute per liter of solution. To prepare a 1 M solution, slowly add the molecular weight (x g/mol) of compound to 500-mL distilled or deionized water in a 1000-mL volumetric flask half filled with distilled or deionized water. Allow the compound to dissolve completely, swirling the flask gently if necessary. Once the solute is completely dissolved and the solution is at room temperature, dilute to the mark with water. Invert the flask several times to mix.

To make a 1 M solution of sodium hydroxide (40g/mol), slowly add 40 g sodium hydroxide to 500 mL distilled or deionized water in a 1000-mL volumetric flask. When all the solid is dissolved and the solution is at room temperature, dilute to the mark and invert the flask several times to mix.To make a 1 M solution of acetic acid, dissolve 60.05 g acetic acid in 500 mL distilled or deionized water in a 1000-mL volumetric flask. Since acetic acid is a liquid, it may also be measured by volume. Divide the mass of the acid by its density (1.049 g/mL) to determine the volume (57.24 mL). Use either 60.05 g or 57.24 mL acetic acid to make the solution. Swirl the flask gently to mix the solution. When the solution is at room temperature, dilute to the mark and invert the flask several times to mix. Always add acid to water

2.
Percent solutions

a.
Mass percent means the number of grams of solute per 100 g of solution. For example, 10 g sodium chloride in 90 g water is a 10% by mass solution.

mass percent = mass of solute/mass of solution= 10 g / (10 g + 90 g) x 100%= 10%

b.
Volume percent means the number of milliliters of solute per 100 mL of solution. The volume percent of a solution cannot be calculated directly from the volumes of its components because the final volume may not equal the sum of the components’ volumes. To prepare volume percent solutions, first determine the final volume and concentration of the desired solution and then determine the amount of solute. Dilute the solute in sufficient solvent to produce the final volume of desired solution. For example, to prepare 100 mL of a 10% by volume solution of acetic acid, dilute 10 mL acetic acid with distilled or deionized water to make 100 mL of solution.
Note: Solutions of concentrated reagents, such as 37% hydrochloric acid and 85% phosphoric acid, are percent solutions by mass. In general, percent solutions are by mass.

3.
Dilutions

When preparing a dilution, decide the volume and molar concentration of the resulting solution that you require. Use the following equation to determine how much of the concentrated reagent is needed to prepare the diluted solution,

M reagent x V reagent = M dilution x V dilution

where M is molarity and V is volume.

Slowly add the calculated volume of concentrated reagent to a proper-sized volumetric flask half filled with distilled or deionized water and swirl the flask to mix. Once the solution is at room temperature, dilute to the mark with water and invert the flask several times to mix.

For example, what volume of 10 M acetic acid is required to prepare 1.0 L of 0.50 M acetic acid?

10 M x V reagent = 0.50 M x 1.0 L V reagent = 0.050 L = 50 mL

A volume of 50 mL of 10 M acetic acid is required to prepare 1.0 L of 0.50 M acetic acid.

4.
Special cases

Often it is necessary to prepare solutions from chemicals that are less than 100% pure. To prepare solutions from these impure chemicals, first decide the volume and molarity of the required solution. Multiply the solution’s volume by its molarity. The product (n) is the number of moles of pure chemical needed to produce that solution.

M pure x V pure = n pure

Because the percent purity of chemicals sold commercially is measured by mass, first calculate the mass of the pure chemical needed to make the solution. Multiply the number of moles of pure chemical times the gram formula weight of the chemical.

mass of pure chemical = n pure x gram formula weight

The mass of the impure chemical times the percent purity in decimal form equals the mass of the pure chemical. Divide the mass of pure chemical by the percent purity to yield the mass of the impure chemical.
mass of pure chemical = mass of impure chemical x percent purity mass of impure chemical = mass of pure chemical / percent purity

The above equations may be combined into one equation.

mass of impure chemical = M pure x V pure x gram formula weight / percent purity

Use this equation if the chemical in question is a solid.

For example, what mass of potassium hydroxide that is 85.9% pure is needed to prepare 1.0 L of a 0.25 M solution of potassium hydroxide? The gram formula weight of potassium hydroxide is 56.11 g/mol.

mass of impure chemical = M pure x V pure x gram formula weight/percent purity
= 0.25 M × 1.0 L × 56.11 g/mol ÷ 0.859= 16 g

If the chemical in question is a liquid, then one more calculation is required. Divide the mass of the impure chemical by its density to yield the volume of chemical.

volume of impure chemical in mL = mass of impure chemical in g/density of impure chemical in grams per milliliter
Again, combine the previous equations.

volume of impure chemical = M pure x V pure x gram formula weight / (percent purity x density)
For example, what volume of hydrochloric acid that is 37.1% pure is needed to prepare 1.0 L of a 0.10 M solution of hydrochloric acid? The gram formula weight of hydrochloric acid is 36.46 g/mol, and the density of 37.1% hydrochloric acid is 1.2 g/mL.

volume of impure chemical = M pure x V pure x gram formula weight / (percent purity x density)
= 0.10 M × 1.0 L × 36.46 g/mol ÷ (0.371 x 1.2 g/mL)= 8.2 mL

5.
Normal solutions

Another concentration term sometimes used is normality. Normality (N) means the number of equivalents of solute per liter of solution. An equivalent is defined separately for acid-base and reduction-oxidation (redox) chemistry.
In acid-base chemistry, an equivalent is the mass of chemical that donates or accepts one mole of protons. For example, sulfuric acid is a diprotic acid. One-half mole of sulfuric acid therefore provides one mole of protons. To prepare a 1 N solution of sulfuric acid, slowly add 0.5 gram formula weight of sulfuric acid to a clean 1-L volumetric flask and fill to the mark with distilled or deionized water.

In redox chemistry, an equivalent is the mass of chemical that donates or accepts one mole of electrons. Determine the number of electrons a chemical donates or accepts from its half-reaction. For example, one mole of aluminum (III) reacts with 3 moles of electrons to give one mole of aluminum metal.

Al 3+ + 3e – Al

To prepare a 1 N solution of aluminum (III), slowly add 0.333 g formula weight of an aluminum (III) compound to a clean 1-L volumetric flask and fill to the mark with distilled or deionized water.

Tincion de azul coomassie para geles de poliacrilamida (PAGE)

2006-03-13T16:54:00.000-06:00

Tincion, decoloracion y secado de geles de poliacrilamida (PAGE)

Para teñir el gel
1). Una vez que ha finalizado la corrida electroforetica, retirar el gel del casette y colocarlo en un recipiente hermetico de plastico (tuper)
2). Añadir 50 mL de la solucion de tincion
3). Incubar a 22 oC, 12 h, en agitacion continua

Para desteñir el gel
1). Incubar en 50 mL de solucion destiñidora durante una hora
2). Repetir el procedimiento dos o tres veces mas hasta que aparezcan las bandas teñidas de azul y el fondo casi transparente

Para secar el Gel
1). Incubar durante 12 h en glicerol al 20% en agua BD.
2). Fotografiar o escanear
3). Secar en el bastidor de acrilico a 22 oC durante dos o tres dias. (se puede acelerar el proceso si se le coloca un foco incandescente de 60 W lo mas cercano posible al gel, pero sin que llege a tocarlo).

Solucion de tincion
1). 2.5 g Azul Brillante Coomassie R-250
2). 450 mL metanol
3). 100 mL acido acetico glacial
4). Aforar a 1 L con agua BD
Nota: Esta solucion se puede recuperar y reusar nuevamnte si se filtra y se mezcla con la solucion de coomassie

Solucion destiñidora
1). 200 mL de metanol
2). 150 mL de acido acetico
3). 650 mL de agua BD
Nota: Esta solucion se puede recuerar y reusar si se filtra con un poco de carbon activado.

Tincion de plata para gel de poliacrilamida (PAGE)

2006-03-13T12:01:00.000-06:00

Tincion con plata para gel de poliacrilamida (PAGE)

1). Nuca tocar el gel con los dedos desnudos, use guantes
2). Inmeditamente despues de retirar el gel (8 x 10 cm, de 1 mm de espesor) del casette donde se realizo la corrida electroforetica, coloquelo en un recipiente de vidrio con 100 mL de metanol al 40% y acido acetico al 10% durante 60 min.
3). Incubar con 100 mL de metanol al 40% por 30 min
4). Incubar con 100 mL de agua BD por 30 min
5). Incubar con 100 mL de tiosulfato de sodio al 0.01% en agua durante 1 min
6). Enjuagar con 100 mL de agua DB durante 5 min, repita este mismo paso un vez mas
7). Incubar con 100 mL de cloruro de plata al 0.1 % durante 30 min a 4 oC
8). Enjuagar con 100 mL de agua DB durante 5 min. y repita un vez mas.
9). Incubar con 100 mL de cabonato de sodio al 2% en formalina (formol al 35%) al 0.04% revelador durante 5 min y repita una vez mas
10). Incubar con 100 mL de acido acetico al 5% durante 10 min.
11). Incubar con 100 mL de acido acetico al 1% antes de fotografiar o escanear
12). Enjuagar con 100 mL de agua BD tres veces
13). Incubar en glicerol al 20% en agua BD durante 12 h.
14). Secar en marcos de acrilico y papel celofan.

Teapeutica antioxidativa (01)

2006-03-09T20:00:00.000-06:00

Terapeutica antioxidativa (antioxidantes orales)

Ensalada de apio y naranja

Ingredientes para 4 personas (o dos tragones)

1). Una rama de apio, lavado, incubado previamente a 90oC durante 8 min, y cortado en cubitos
2). 8 nueces peladas (16 mitades), cortadas en pedacitos asi de chiquitos.
3). 4 aceitunas negras
4). 4 aceitunas verdes
5). 2 naranjas peladas y en gajos
6). Mezclar vigorosamente
7). 4 cucharadas de aceite de oliva.
8). 1 limón.
9). 1 cucharadita de mostaza.
10). Perejil
11). Sal y pimienta
12). Lechugas variadas
13). Mezclar vigorosamente
14). Disfrutar en compañia de buen@s amig@s y con alguna otra de la recetas previas.

Comentario dietetico

Las ensaladas son platos muy nutritivos y fáciles de elaborar.
Esta receta presenta una ensalada de apio y naranja, ambos alimentos de bajo contenido calórico y ricos en vitaminas, minerales y sustancias con acción antioxidante.
Se añaden también otros alimentos con propiedades atioidativas como nueces y aceitunas, fuente de grasas insaturadas que contribuyen a disminuir los niveles de colesterol en sangre.
Los vegetals son ricos en fibra, vitaminas y minerales.
La variedad de ingredientes y su colorido, los convierten en un plato muy apetecible y atractivo.

Determinacion de fosfato total

2006-03-09T18:51:00.000-06:00

Determinacion de fosfato total

1). Pesar 0.5 mg de muestra de tejido (en un tubo Pyrex)
2). 50 uL de nitrato de magnesio al 10%
3). Evaporar hasta secar directamente sobre a llamade un mechero (no muy intensa)
4). Enfriar a temperatura ambiente
5). 300 uL de HCl 1 N
6). Inubar a 100oC, 15 min. (baño maria o seco)
7). 700 uL de Ac. ascorbico / molibdato (1 parte a 6 partes mezcladas justo antes de añadir)
8). Incubar a 45 oC, 20 min.
9). Leer la absorbancia a 820 nm contra el blanco de reactvos (la absorbanbcia cae enter 0.240 for 0.01 µmol fosfato).

Peparacion de la curva de calibracion

0.001 M de fosfato use 100, 200, 300, 400, 500 ul y afore a 500 ul de volumen final con agua BD.

Reactivos

Nitrato de magnesio al 10% disuelto en etanol
HCl 0.1 M
Acido ascorbico al 10% (1 g/10 mL)
Molbdato de amonio 0.42% en acido sulfurico 1 N (0.42 g + 2.66 mL H2SO4 y aforar a 100 mLcon agua BD)

* El acido ascorbico es estable a 2 - 4oC durante aprox. 7 semanas.

Induccion de citocromo P-450

2006-03-03T00:47:00.000-06:00

Induccion de citocromo P-450 via oral con etanol tipo Ron

1). 40 mL de etanol bebestible (Ron Potosi Añejo [Mexico], Ron Matusalen Clasico [Rep. Dominicana], o Ron Cacique Añejo [Venezuela]).
2). 250 mL de refresco (soda) de sabor cola (xx-cola).
3). 3 a 10 mL de extracto fresco de limon
4). Mezclar con gentileza
5). Disfrutar con tranquilidad y en compañia de buena-os amiga-os
6). Repetir la dosis unas dos veces o tres veces mas (no abusar de su consumo debido a sus efectos secundarios ya que se genera estres oxidativo por exceso de aldehidos, acetonas, y oxidrihilos, ademas de otros efectos secundarios mejor conocidos y sufridos)
7). No consumir esta mezcla si se tiene que manejar, poco antes de algun examen, o de andar de galan, ya que el alcohol invita pero no ayuda.
8). No mezclar con ningun otro tipo de farmacoterapia.
9). Se puede acompañar de alimentos de buena manufactura como jamones, encurtidos y semillas variadas.
10). Una vez ingeridas las dosis arriba recomendadas es conveniente tomar un par de vasos de agua mineral, e irse a dormir.

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida - SDS

2006-02-24T18:14:00.000-06:00

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida - SDS
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

Gel separador

El volumen total es de 8 mL (suficiente para dos minigeles de 10 x 8 cm)

Para geles con concentracion de: - 12% - 10% - 8% - 6% -
Mezcla de acrilamida/bisacrilamida - 4.32 mL - 3.6 mL - 2.884 mL - 2.16 mL -
Tris-HCl 1 M pH 8.8 - 3 mL - 3 mL - 3 mL - 3 mL -
Agua BD - 560 uL - 1.28 mL - 1.996 mL - 2.72 mL -
SDS al 10% - 80 uL - 80 uL - 80 uL - 80 uL -
Persulfato de amonio al 10% - 40 uL - 40 uL - 40 uL - 40 uL -
TEMED - 5 uL - 5 uL - 5 uL - 5 uL -

Nota: Una vez vertido el gel es conveniente adicionar unos 500 - 1000 uL de metanol para facilitar la gelificacion "pareja", se debera retirar antes de añadir el gel concentrador.

Gel concentrador

El volumen total es de 4.5 mL (suficiente para dos minigeles)
~4.8% acrilamida/bis
1). 1 mL dezcla de Acrilamida/Bisacrilamida
2). 2.8 mL Agua BD
3). 625 uL Tris-HCl 1 M, pH 6.8
4). 50 uL de SDS al 10%
5). 25 uL de Persulfato de amonio al 10%
6). 5 uL TEMED

Preparacion de las soluciones

Acrilamida-Bisacrilamida (relacion 37:1)

1). 22.2 g acrilamida
2). 0.6 g bis-acrilamida
3). Aforar a 100 ml con agua BD.

Buffer de corrida

1). 57.6 g Glicina
2). 12 g Tris base
3). 4 g SDS
4). Aforar a 4 L con agua BD

Solucion de tincion

1). 2.5 g Azul Brillante Coomassie R-250
2). 450 mL metanol
3). 100 mL acido acetico glacial
4). Aforar a 1 L con agua BD

Solucion destiñidora

1). 300 mL metanol
2). 400 mL acido acetico
3). Aforar a 4 L con agua BD

Buffer de muestra 5X (10 mL)

1). 3.125 mL Tris-HCl 1 M, pH 6.8
2). 1 g de SDS
3). 2.5 mL de glicerol
4). 75 uL de azul de bromofenol al 2% disuelto en etanol puro.
5). 1 uL de 2-mercaptoetanol
6). Aforar a 10 mL con agua BD

Determinacion de proteinas con Acido Sulfosalicilico

2006-02-07T17:21:00.000-06:00

Determinacion de proteinas con Acido Sulfosalicilico

1). Muestra: 20-50 uL de plasma; 100 uL de saliva, 200 uL de orina o LCR
2). Aforar a 500 uL con agua BD
3). 1000 uL de acido sulfosalicilico al 3% (Quimica Monterrey)
4). Incubar a 22ºC durante 10 min y en agitador orbital
5). Leer a 492 nm

Curva de calibracion

1). 0, 5, 10, 20, 40, 80, 150, 250, 500, 750 y 1000 ug / mL de BSA (2 mg / mL)
2). Aforar 500 uL con gua BD o buffer.

Nota: Esta medicion se basa en la preipitacion de proteinas y es muy reproducible
El acido sulfosaliciilico es muy estable a temperatura ambiente (+ de 6 meses)

PBS Buffer

2006-02-07T17:15:00.000-06:00

PBS: Buffer de uso frecuente (receta para 1 L)

PBS Buffer de fosfatos pH 7.4

1). 8 g (137 mM) NaCl
2). 0.2 g (2.7 mM) KCl
3). 1.44 g (10 mM) NaHPO
4). 0.24 g (2mM) KHHPO
5). 800 mL agua BD
6). Ajustar pH a 7.4 con HCl
7). Aforar a 1 L.

Nota: Conservar a 4-8 °C
Es estable por tres o mas meses.
Desechar si aparecen cambios de coloracion o precipitados

=======

Buffer de fosfatos 100 mmol/L, pH 7.0

1). A 800 mL de agua BD
2). 12.95 g fosfato de sodio dibasico dihidratado [Na2HPO4 2H2O]
3). 4.95 g Fosfato de potasio dibasico anhidro [KH2PO4]
4). 0.5 g de azida de sodio [NaN3] (que se puede eliminar si es necesario)
5). Ajuste el pH a 7.0
6). Afore a 1 L

Nota: Añadanse de uno en uno y espere hasta que es bien disuelto antes de añadir el siguiente ingrediente.
Esta solucion es estable por 3-4 meses a 2-8 ºC.

Precipitacion de proteinas con ATC para PAGEs

2006-02-07T17:10:00.000-06:00

Precipitacion de proteinas con acido triclooacetico

Juan M. Gallardo
Protocolos de laboratorio

Esta técnica se utiliza para concentrar proteinas para usarlas en los geles de poliacrilamida (SDS PAGE).

Si la cantidad de protena que se desea precipitar es menor de 5 ug, se puede añadir insulina o albumina como acarreador (10 ug de insulina (Sigma Insulin I - 5500)

1). A una alícuota de la muestra añadir un volumen igual de TBA (acido tricloroacetico) al 20%
2). Incubar en hielo durante 30 min.
3). Centrifugar a 4 °C durante 15 min.
4). Retire con sumo cuidado todo el sobrenadante.
5). Añadir ~300 uL de acetona helada.
6). Centrifugar a 4 °C durante 5 min.
7). Descartar el sobrenadante y secar con aire (a muy baja presiópn) la pastilla.
8). Resuspenda la pastilla en el buffer de muestra 4X.
9). Incube a 65 °C por 4 min.
10). Cargar en el gel de poliacrilamida.

Determinacion de la peroxidacion lipidica (MDA)

2006-02-07T15:57:00.000-06:00

Malondialdehido (MDA) en plasma y tejidos.

1). 400 uL de plasma o sobrenadante de tejidos
2). 200 uL de un mezcla de reactivos
(8.0% SDS,
1.5 mL acido acetico al 20% (pH 3.5),
1.5 mL de acido tiobarbiturico al 0.8%,
300 uL de butil-hidroxi-tolueno al 4% (w/v) y
300 uL de agua BD)
3). Incubar a 95°C durante 60 min.
4). 1.0 mL agua BD
5). 5.0 mL de n-butanol-piridina (15:1, vol/vol)
6). Mezcar vigorozamente
7). Centrifugar a 2,000 g durante 15 min.
8). Conservar el sobrenadante
9). Leer la absorbancia en un espectrofotometro a 532 nm.
10). Curva de calibracion con MDA bis-dimethyl acetal (Sigma) de 0 a 500 nanomoles MDA
11). Se expresa en nanomoles de MDA por miligram de proteina otal.

La variabilidad intra-ensayo en cinco set (de tres replicados) y el coeficiente de variacion fue del 8.9 ± 2.4%.

Referencia.

Ohkawa, H, Ohishi N, and Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 95: 351-358, 1979

Otros procedimentos

2006-01-25T16:54:00.000-06:00

Determinacion de productos finales de la glucosilacion (Advanced Glycated End Product, AGEs)

Determinacion de Productos finales de la oxidacion de Proteinas (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP)

Determinacion de carbonilos totales

Determinacion de tioles

Determinacion de acido sialico

Determinacion de catalasa

Determinacion de colagena soluble

Determinacion de dienos conjugados

Determinacion de MMP-9 y MMP2 en geles de Zimografia en gelaina

Electroforesis vertical (para proteinas, zimografia, o como paso previo al Western Blot.

y varios protocolos mas ue se iran publicando conforme pueda.

Obtencion de suero

2006-01-24T18:45:00.000-06:00

Obtencion de suero de sangre completa para la recuperacion de anticuerpos.

1). Obtenga una muestra de sangre completa en un tubo de vidrio
2). Incube a 37 oC durate 1 h, hasta que la sangre este bien coagulada
3). Refrigerar la muestra a 4 oC durante 12-16 h para permitir que el coagulo sanguineo se retraiga
4). Utilizando una pipeta pastur, retire cuidadosamente el coagulo y apoyandolo en la pared del tubo. Es imporante no lisar los eritrocitos del coagulo.
5). Centrifugar el suero a 4000 rpm durante 20 min a 4 oC.
6). Etiquetar y conservar el sobrenadante a -20 oC.
Nota: Para ciertos calculos es indispensable anotar el volume total de sangre y el volumen final de suero.

Medicion del tiempo de sangrado

2006-01-24T18:41:00.000-06:00

Medicion del tiempo de sangrado

Aunque esta tecnica ya practicamente se ha dejado se usar debido a la llegada de nuevos y mejores metodos, todavia tiene utlidad, ver: "Idiopathic Thrombocytopenic Purpura: A practice Guideline Developed by Explicit Methods for the American Society of Hematology"

Protocolo 1

1). Anestesie al raton.
2). Haga una pequeña insicion en la vena dorsal de la cola usando la punta del bisturi.
3). Sumerja la cola en NaCl 0.9% a 37.5 oC
4). Mida con un cronometro el tiempo desde el incio del sangrado hasta la sangre deje de fluir espontaneamente

Protocolo 2

1). Anestecie al raton
2). Haga una pequeña inscion en la vena dorsal de la cola usando la punta del bisturi.
3). Aplique cada 15 seg una tira de papel (Whatman 3MM) durante 5 seg hasta que la sangre deje de fluir lo que se aprecia por que ya no se tiñe la tira.

Referencia

Carl W; Jackson et al. Consequences of GATA-1 deficiency in megakaryocytes and platelets. Blood 1999;93:2867-2875.

Sopa de cebolla

2006-01-24T18:09:00.000-06:00

Sopa de cebolla segun una receta Zacatecana

En una cazuela grande preferentemente de barro (evite el que esta vidriado porque desprende plomo)
1). 3 cucharadas soperas de mantequilla (puede substituirse por margarina ICBI)
2). 2 cucaradas soperas de aceite de oliva.
3). Incubar con la llama de fuego en baja
4). Añadir de 1 a 1.5 kg de cebollas (de la region de Loreto, Zacatecas) cortadas en tiras muy delgadas
5). Incrementar la temperatura con la llama a fuego medio e incubar durante 20 a 30 minutos (con la cazuela tapada) o hasta que esten transparantes (como un gel de agarosa a muy baja concentracion, o menor).
6). Añada una chucharada cafetera de azucar morena (de ingenios tamaulipecos)
7). Añada una cucharada sopera del polisacarido marca Maizena
8). Aumente la llama del fuego a lo mas alto e incubelas por unos 10 minutos mas y de tanto en tanto saltealas (tomaran una coloracion ambar tendiendo al obscuro)
9). Añada dos tazas de caldo de res (o de pollo segun su preferencia, los de cubito van bien)
10). Mezclar bien (nosotros usamos una palita de madera michoacana)
11). Añada 4-5 tazas mas de la solucion señalada en el punto No. 8
12). Añada 500 mL de vino blanco (alguien me comento que el rosado tambien funciona pero nosotros no lo hemos ensayado, de preferencia de la region de calafia, Mexico)
13). Incube a fuego alto por unos 30-40 min. mas (se trata de concentrar la solucion caldosa)
14). Añada unos gramos de sal y pimienta negra al gusto (esta ultima molida al momento de añadirese)
15). Dore varias rebanadas de pan bolillo en margarina (en corte diagonal se ven mas bonitas) y coloquelas en el fondo de un tazon (cualquiere es bueno, por los de barro se ven mas bonitos).
16). Vierta la mezcla de cebollas junto con el caldo
17). Coloque una generosa cantidad de queso rallado fresco (zacatecano) o estilo chihuahua (nosotros se los compramos a los menonitas de Miguel Auza, Zacatecas) o de perdis manchego.
18). Consumase lo antes posible y bien caliente, acompañelas con el resto del vino blanco.

Nota 1:. Tanto la mezcla de cebolla como de vino contienen agentes antioxidantes.
Nota 2: La sopa de cebolla no sabe a cebolla fresca (por aquello de que algunos no nos gusta la cebolla cruda).

Determinacion de fosfato total

2006-01-24T17:59:00.000-06:00

Determinacion de fosfato total

En tubo de esayo de vidrio borosilicado con tapa de rosca.

1). Prepare la curva estandar con fosfato de sodio en las siguientes concentraciones (uM): 0, 2, 5, 7, 10, 20, 40, 60, y 80 uM.

2). Deshidrate las muestras y los estandares con nitrogeno gaseoso en un evaporador.

3). 150 uL de acido perclorico al 70%.

4). Incube las muestras y estandares a 180 oC durante la noche o si los bloques son precalentados el tiempo de incubacion se puede reducir a 2 h.

5). Enjuage las paredes del tubo con 830 uL de agua ultrapura

6). Vortex7). 170 uL de molibdato de sodio al 2.5% (p/v)8). Vorex

9). 170 uL de acido ascorbico al 10% (p/v), preparese en fresco antes de usar.

10). Vortex.

11). Incubar a 50 oC durante 15 min.

12). Incubar a 22 oC durante 10 min.

13). Leer la absorbancia a 820 nm.

Determinacion de glucosaminos

2006-01-24T17:54:00.000-06:00

En tubo de vidrio borosilicato con tapa de rosca.

1). 100 uL de muestra (la sensibilidad es de unos 0.5 - 10 µg GlcN).

2). 500 uL de HCl 2N

3). Burbuje la solucion con nitrogeno gaseoso

4). Cierre firmemente la tapa del tubo e incube a 100 oC durante 16 horas (use un baño seco, nosotros usamos el de Kit-Lab. El Paso, Texas, USA)

5). Para preparar la curva estandar use glucosaminos en la concentracion de 0 - 20 µg GlcN de una solucion stock de 1.5 mg/mL. (Use 0, 3, 5, 8, 10, 12 uL de la solucion stock y añada agua para aforar a 300 µL. Despues añada 300 µL de HCl 4N para obtener un volumen final de 600 uL y una concentracion de HCL de 2N). Las soluciones de la curva estandard no necesitan de hidrolisis.

6). Una vez finalizada la hidrolisis, tanto a las muestra como a los estandares se le añade 400 uL de Na2CO3 2M (10.6 g en 50 mL con pH - 7 con un ligero exceso de Na2CO3)

7). Agite suavemente

8). Añada 500 uL de acetil-acetona (preparar en fresco) al 2% en Na2CO3 1.5M (15.9 g carbonato de sodio + 2 mL de acetil acetona y agua para aforar a 100 mL).

9). Cierre el tubo firmemente en incube a 100 oC durante 20 min.

10). Enfriar en agua con hielo

11). 1000 uL de etanol

12). 500 uL ml del reactivo de Ehrlich (1 g de p-dimetilaminobenzaldehido en 15 mL de EtOH y 15 mL HCl conc.)

13). Agite en vortex para expeler el exceso de CO2

14). Se formara una coloracion en unos 5 min, y este cromoforo es estable por 1-2 horas.

15). Lea la absorbancia a 530 nm.

NOTA: NaCl afecta e desarrollo del color, es por ello que TODAS muestras y estandares tengan la misma concentracion de sal con el proposito de evitar variaciones en la coloracion. La dialisis ayuda a remover el NaCl pero consume mas tiempo y reactivos, vease DIALISIS.

Determinacion de carbohidratos totales

2006-01-24T17:51:00.000-06:00

En tubo de ensayo de vidrio borosilicato

1). 10 uL - 50 µL de muestra
2). 19 uL - 95 µL de agua bidestilada
3). 10 uL - 50 µL de fenol al 80% (80% de fenol en peso disuelto en agua)
4). Vortex.
5). 400 uL - 2000 µL de acido sulfurico concentrado.
6). Incubar a 22 ºC durante 10 min.
7). Transferir 150 µL a un pozo de una microplaca de 96 pozos
8). Leer la absorbancia a 490nm en el lector de ELISA.
9). Curva de calibracion: Glucosa 1 mg/mL, usar: 0,10, 20, 40, 60 80 y 100 µL y aforara con agua bidestilada a 100 µL

Referencia

Dubois M, Giles K, Hamilton JK, Rebes PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and relatessubstances. Anal Chem 1956;28:350-356.

Determinación de proteínas (Bradford)

2006-01-24T17:48:00.000-06:00

La medición de las proteínas totales se basa en el método descrito por Marion Bardford (cita)

1). Muestra:
Plasma: 2 o 5 uL, aforar a 50 uL con agua bidestilada
Orina, saliva o LCR: 10 o 20 uL aforar a 50 uL con agua bidestilada
2). Curva de calibración: Albúmina bovina serica (BSA), 1 mg / mL.: 0, 2, 4, 8, 10, 15, y 20 uL
3). Buffer o Agua bidestilada (milli Q): 50, 48, 46, 42, 40, 35, y 30 uL
4). Reactivo de Bradford: 200 uL
5). Agitar suvamente (en agitador robital)
6). Incubar a 22 oC durante 5 min.
7). Leer la microplaca en un lector de microplacas a 595 nm.

Determinacion de nitrito/nitrato (Griess)

2006-01-24T17:44:00.000-06:00

Determinación de óxido nítrico

La medición de los nitritos totales (NO2-) se basa en la reacción de Griess (cita)

1). Muestra: plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, etc. (Previamente desproteinizados): 10, 20 o 50 uL
2). Agua bidestilada o milli-Q: 40, 30 o 0 uL
3). Curva de calibración: NaNO2, 100 uM.: 0, 2, 4, 8, 15, 30 y 50 uL
4). Agua bidestilada (milli Q): 50, 48, 46, 35, 20, y 0 uL
5). Sulfanilamida (Sigma) al 1%: 100 uL
6). Agitar suavamente (en agitador robital)
7). Incubar a 22 oC durante 15 min en oscuridad
8). N-naftilendiamina dihidroclorada (NED, Sigma) 0.1%: 100 uL
9). Agitar suavemente (en agitador orbital)
10). Incubar a 22 oC durante 15 min. en oscuridad
11). Leer la microplaca en un lector de microplacas a 540 nm.