martes, febrero 07, 2006

Precipitacion de proteinas con ATC para PAGEs

Precipitacion de proteinas con acido triclooacetico

Juan M. Gallardo
Protocolos de laboratorio

Esta técnica se utiliza para concentrar proteinas para usarlas en los geles de poliacrilamida (SDS PAGE).

Si la cantidad de proteina que se desea precipitar es menor de 5 ug, se puede añadir insulina o albumina como acarreador (10 ug de insulina (Sigma Insulin I - 5500)

1). A una alícuota de la muestra añadir un volumen igual de TBA (acido tricloroacetico) al 20%
2). Incubar en hielo durante 30 min.
3). Centrifugar a 4 °C durante 15 min.
4). Retire con sumo cuidado todo el sobrenadante.
5). Añadir ~300 uL de acetona helada.
6). Centrifugar a 4 °C durante 5 min.
7). Descartar el sobrenadante y secar con aire (a muy baja presiópn) la pastilla.
8). Resuspenda la pastilla en el buffer de muestra 4X.
9). Incube a 65 °C por 4 min.
10). Cargar en el gel de poliacrilamida.

7 Comments:

Blogger JoLu said...

Hola, estoy por realizar una prueva de SDS-PAGE pero mis proteinas estan muy diluidas, veo en algunas fuentes que el la sensibilidad de esta tecnica es de 50ng ocea 0,05mg cuando tu comentas que el minimo es 5mg, que opinas? quizas tengas bibliografia que me puedas mandar para corroborar tu dato,

muchas gracias

Joseluis Málaga
UCSM

11:27 p.m.  
Blogger labtox said...

LoLu

Lo que puedes hacer es concentrarla con un filtro de centriron (r) http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/Millipore_Centricons.pdf

Saludos

12:25 a.m.  
Blogger MAY said...

ESTIMADO SR:

ESTOY REALIZANDO LA DETECCION DE PROTEINAS FOSFORILADAS ATRAVEZ DE WESTERN BLOT, PERO MI PROTEINA ESTA MUY DILUIDA Y LA QUIERO CONCENTRAR LO INTENETE USANDO EL SPEEDVAC PERO SE DEGRADA MI PROTEINA QUE OTRA TECNICA PODRIA USAR SIN AFECTAR LA FOSFORILACION DE MI PROTEINA.

MUCHAS GRACIAS POR SU AYUDA
MAYRUT URIOSTEGUI

4:32 p.m.  
Blogger MAY said...

ESTIMADO SR:

ESTOY REALIZANDO LA DETECCION DE PROTEINAS FOSFORILADAS ATRAVEZ DE WESTERN BLOT, PERO MI PROTEINA ESTA MUY DILUIDA Y LA QUIERO CONCENTRAR LO INTENETE USANDO EL SPEEDVAC PERO SE DEGRADA MI PROTEINA QUE OTRA TECNICA PODRIA USAR SIN AFECTAR LA FOSFORILACION DE MI PROTEINA.

MUCHAS GRACIAS POR SU AYUDA
MAYRUT URIOSTEGUI

4:32 p.m.  
Blogger MAY said...

ESTIMADO SR:

ESTOY REALIZANDO LA DETECCION DE PROTEINAS FOSFORILADAS ATRAVEZ DE WESTERN BLOT, PERO MI PROTEINA ESTA MUY DILUIDA Y LA QUIERO CONCENTRAR LO INTENETE USANDO EL SPEEDVAC PERO SE DEGRADA MI PROTEINA QUE OTRA TECNICA PODRIA USAR SIN AFECTAR LA FOSFORILACION DE MI PROTEINA.

MUCHAS GRACIAS POR SU AYUDA
MAYRUT URIOSTEGUI

4:34 p.m.  
Blogger yryx Luna said...

Hola mis muestras parecen tener muchos libidos como puedo separar mis proteínas de ellos.

sin la utilización de fenol
gracias

12:38 p.m.  
Blogger yryx Luna said...

Hola

tengo mi muestra muy cargada de lípidos lo que no me da una buena resolución en mi gel.
me podría pasar un protocolo para la separación de proteínas.

sin el uso de fenol
Gracias

12:41 p.m.  

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