Determinación de creatinina

Determinación de creatinina

1]. 5 uL de muestra (plasma desproteinizado, u orina)
2]. 45 uL de agua BD
3]. 50 uL de ácido pícrico 1%
4]. 50 uL de NaOH 10%
5]. Agitar suavemente
6]. Incubar a 22 oC, 3 min.
7]. Leer a 540 nm (también se puede leer a 492, 500, y 510 nm según se disponga de filtros en el lector de microplacas)
8]. La reacción es estable durante unos 30 min, después de ese tiempo se incrementa.

Curva de calibración

Creatinina (1 ug/uL): 0, 2, 4, 8, 15, 30, y 50 uL
Agua BD: 50, 48, 46, 42, 35, 20, y 0 uL
Ácido pícrico (1%): 50 uL a todos los pozos
NaOH (10%): 50 uL a todos los pozos
Volumen de muestra: 5, 10, o 15 uL

Preparacion de los reactivos:

Ácido pícrico 1%
1 g de ácido pícrico (Sigma).
Aforar a 100 mL con agua BD

NaOH 10%
10 g de NaOH (Química Monterrey, Monterrey Mex)
100 mL de HCL al 0.1 N (High Purity, Mexico, D.F)

Estandar de creatinina 1 mg/mL
0.1 g de creatinina (Sigma)
100 mL de HCL 0.1 N

Zimografia (Gel de poliacrilamida copolimerizado con gelatina)

I. Muestra
Muestra (plasma, homgenado de tejido, liquido de dialisis, etc - 50 ug de proteina total

II. Gel de poliacrilamida co-polimerizado con gelatina
Gel Separador (8 mL, suficiente para dos geles de la camara miniprotean de BioRad)

1. 2880 uL Agua bidestilada (BD, milliQ)
2. 800 uL Gelatina 10 mg/mL (Sigma, USP, etc) (Conc. final: 1 mg gelatina/mL de gel)
3. 2160 uL Acrilamida/bis al 30% (Amresco)
4. 2160 uL Tris-Cl 1.5 M pH 8.8 (Amresco)
5. 80 uL SDS al 10% (Sigma)
6. 80 uL Persulfato de amonio al 10% (Amresco)
7. 6 uL TEMED (Amresco)

Gel concentrador (2 mL, suficiente para dos geles de la camara miniprotean de BioRad)

1. 1400 uL Agua BD
2. 330 uL Acrilamida/bis al 30% (Amresco)
3. 250 uL Tris-Cl 1.0 M pH 6.8 (Amresco)
4. 20 uL SDS al 10% (Sigma)
5. 20 uL Persulfato de amonio al 10% (Amresco)
6. 4 uL TEMED (Amresco)

III. Preparacion de las muestras

• Se utiliza la tercera parte del bufer de muestra con base en el volumen total de la muestra con proteinas.
• Se mezclan en vortex y se incuban a temperatura ambiente durante 30 min (NO HERVIR)

IV. Bufer de muestra para MMP-9 4X (10 mL)

1. 1 g SDS (conc final 2.5%)
2. 0.8 g Sacarosa (Prod. Quim. Monterrey)
3. 400 uL Sol. Rojo de Fenol al 1% (conc. final 0.01%)
4. 10 mL agua BDV.

V. Corrimiento del gel

• Aplicar las muestras (habitualmente entre 10 y 25 uL)
• Correr el gel con 1X de Tris-glicina-SDS a 75 mV (por gel) a voltaje constante en frio (yo lo coloco dentro del refigerador en la parte mas baja y plana).
• Tiempo de corrida: 1-2.5 horas.
• SIEMPRE HAY QUE ESTAR VIGILANDO EL FRENTE DE COLORANTE.
• La corrida se detiene cuando el rojo de fenol llega a borde inferior del gel y apenas se empieza a salir del mismo.

VI. Lavado de los geles para retirar el SDS

Solucion de renaturalizacion (lavado) (10x) Triton X-100 (Sigma), 25% (v/v) en agua BD

Los geles (por separado) se lavan en 30-50 mL de TritonX-100 al 2.5% durante 20-30 min en agitacion continua (agitador orbital) por tres veces consecutivas

VII. Bufer de revelado 500 mL (10x)

Parace mucho pero si se consume, antes de usarlo diluirlo a 1X

1. 6.25 g Tris base
2. 31.5 g Tris-HCl
3. 58.5 g NaCl
4. 3.7 g CaCl2
5. 12.5 mL Triton X-100
6. 0.2 g Azida de sodio (NaN3, Sigma)
7. 500 mL Agua BD

• Incubar en 50 mL (por cada gel) de esta solucion a 37 oC durante 12 h
• El tiempo de incubacion puede variar mucho y se determiara empiricamente.
• Al inico me salian grandes manchas y para corregir eso opte por incubar a 4 oC durante cuatro dias de esa forma se ven unas bandas bien definidas.
• La mancha depende tambien de la cantidad de las colagenasas en las muestras.

VIII. Tincion de los geles

• Teñir los geles con azul de Coomassie R-250 (Amresco) por 12 h.
• Para mayor contraste se usa al 0.5% (w/v) en lugar de la cocenctracion de 0.1%.

Los geles se destiñen con solucion desteñidora que contiene

1. 500 mL Metanol (High Purity de Mexico)
2. 100 mL Ac. acetico (Prod. Quim. Monterrey)
3. 400 mL Agua BD

Donde se encuentran las metaloproteasas aparecen bandas claras sobre un fondo azul marino, eso significa que se digirio la gelatina de esa zona.