Electroforesis en Gel de Poliacrilamida - SDS

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida - SDS
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

Gel separador

El volumen total es de 8 mL (suficiente para dos minigeles de 10 x 8 cm)

Para geles con concentracion de: - 12% - 10% - 8% - 6% -
Mezcla de acrilamida/bisacrilamida - 4.32 mL - 3.6 mL - 2.884 mL - 2.16 mL -
Tris-HCl 1 M pH 8.8 - 3 mL - 3 mL - 3 mL - 3 mL -
Agua BD - 560 uL - 1.28 mL - 1.996 mL - 2.72 mL -
SDS al 10% - 80 uL - 80 uL - 80 uL - 80 uL -
Persulfato de amonio al 10% - 40 uL - 40 uL - 40 uL - 40 uL -
TEMED - 5 uL - 5 uL - 5 uL - 5 uL -

Nota: Una vez vertido el gel es conveniente adicionar unos 500 - 1000 uL de metanol para facilitar la gelificacion "pareja", se debera retirar antes de añadir el gel concentrador.

Gel concentrador

El volumen total es de 4.5 mL (suficiente para dos minigeles)
~4.8% acrilamida/bis
1). 1 mL dezcla de Acrilamida/Bisacrilamida
2). 2.8 mL Agua BD
3). 625 uL Tris-HCl 1 M, pH 6.8
4). 50 uL de SDS al 10%
5). 25 uL de Persulfato de amonio al 10%
6). 5 uL TEMED

Preparacion de las soluciones

Acrilamida-Bisacrilamida (relacion 37:1)

1). 22.2 g acrilamida
2). 0.6 g bis-acrilamida
3). Aforar a 100 ml con agua BD.

Buffer de corrida

1). 57.6 g Glicina
2). 12 g Tris base
3). 4 g SDS
4). Aforar a 4 L con agua BD

Solucion de tincion

1). 2.5 g Azul Brillante Coomassie R-250
2). 450 mL metanol
3). 100 mL acido acetico glacial
4). Aforar a 1 L con agua BD

Solucion destiñidora

1). 300 mL metanol
2). 400 mL acido acetico
3). Aforar a 4 L con agua BD

Buffer de muestra 5X (10 mL)

1). 3.125 mL Tris-HCl 1 M, pH 6.8
2). 1 g de SDS
3). 2.5 mL de glicerol
4). 75 uL de azul de bromofenol al 2% disuelto en etanol puro.
5). 1 uL de 2-mercaptoetanol
6). Aforar a 10 mL con agua BD

Determinacion de proteinas con Acido Sulfosalicilico

Determinacion de proteinas con Acido Sulfosalicilico

1). Muestra: 20-50 uL de plasma; 100 uL de saliva, 200 uL de orina o LCR
2). Aforar a 500 uL con agua BD
3). 1000 uL de acido sulfosalicilico al 3% (Quimica Monterrey)
4). Incubar a 22ºC durante 10 min y en agitador orbital
5). Leer a 492 nm

Curva de calibracion

1). 0, 5, 10, 20, 40, 80, 150, 250, 500, 750 y 1000 ug / mL de BSA (2 mg / mL)
2). Aforar 500 uL con gua BD o buffer.

Nota: Esta medicion se basa en la preipitacion de proteinas y es muy reproducible
El acido sulfosaliciilico es muy estable a temperatura ambiente (+ de 6 meses)

PBS Buffer

PBS: Buffer de uso frecuente (receta para 1 L)

PBS Buffer de fosfatos pH 7.4

1). 8 g (137 mM) NaCl
2). 0.2 g (2.7 mM) KCl
3). 1.44 g (10 mM) NaHPO
4). 0.24 g (2mM) KHHPO
5). 800 mL agua BD
6). Ajustar pH a 7.4 con HCl
7). Aforar a 1 L.

Nota: Conservar a 4-8 °C
Es estable por tres o mas meses.
Desechar si aparecen cambios de coloracion o precipitados

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Buffer de fosfatos 100 mmol/L, pH 7.0

1). A 800 mL de agua BD
2). 12.95 g fosfato de sodio dibasico dihidratado [Na2HPO4 2H2O]
3). 4.95 g Fosfato de potasio dibasico anhidro [KH2PO4]
4). 0.5 g de azida de sodio [NaN3] (que se puede eliminar si es necesario)
5). Ajuste el pH a 7.0
6). Afore a 1 L

Nota: Añadanse de uno en uno y espere hasta que es bien disuelto antes de añadir el siguiente ingrediente.
Esta solucion es estable por 3-4 meses a 2-8 ºC.

Precipitacion de proteinas con ATC para PAGEs

Precipitacion de proteinas con acido triclooacetico

Juan M. Gallardo
Protocolos de laboratorio

Esta técnica se utiliza para concentrar proteinas para usarlas en los geles de poliacrilamida (SDS PAGE).

Si la cantidad de proteina que se desea precipitar es menor de 5 ug, se puede añadir insulina o albumina como acarreador (10 ug de insulina (Sigma Insulin I - 5500)

1). A una alícuota de la muestra añadir un volumen igual de TBA (acido tricloroacetico) al 20%
2). Incubar en hielo durante 30 min.
3). Centrifugar a 4 °C durante 15 min.
4). Retire con sumo cuidado todo el sobrenadante.
5). Añadir ~300 uL de acetona helada.
6). Centrifugar a 4 °C durante 5 min.
7). Descartar el sobrenadante y secar con aire (a muy baja presiópn) la pastilla.
8). Resuspenda la pastilla en el buffer de muestra 4X.
9). Incube a 65 °C por 4 min.
10). Cargar en el gel de poliacrilamida.

Determinacion de la peroxidacion lipidica (MDA)

Malondialdehido (MDA) en plasma y tejidos.

1). 400 uL de plasma o sobrenadante de tejidos
2). 200 uL de un mezcla de reactivos
(8.0% SDS,
1.5 mL acido acetico al 20% (pH 3.5),
1.5 mL de acido tiobarbiturico al 0.8%,
300 uL de butil-hidroxi-tolueno al 4% (w/v) y
300 uL de agua BD)
3). Incubar a 95°C durante 60 min.
4). 1.0 mL agua BD
5). 5.0 mL de n-butanol-piridina (15:1, vol/vol)
6). Mezcar vigorozamente
7). Centrifugar a 2,000 g durante 15 min.
8). Conservar el sobrenadante
9). Leer la absorbancia en un espectrofotometro a 532 nm.
10). Curva de calibracion con MDA bis-dimethyl acetal (Sigma) de 0 a 500 nanomoles MDA
11). Se expresa en nanomoles de MDA por miligram de proteina otal.

La variabilidad intra-ensayo en cinco set (de tres replicados) y el coeficiente de variacion fue del 8.9 ± 2.4%.

Referencia.

Ohkawa, H, Ohishi N, and Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 95: 351-358, 1979