Otros procedimentos

Determinacion de productos finales de la glucosilacion (Advanced Glycated End Product, AGEs)

Determinacion de Productos finales de la oxidacion de Proteinas (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP)

Determinacion de carbonilos totales

Determinacion de tioles

Determinacion de acido sialico

Determinacion de catalasa

Determinacion de colagena soluble

Determinacion de dienos conjugados


Determinacion de MMP-9 y MMP2 en geles de Zimografia en gelaina





Electroforesis vertical (para proteinas, zimografia, o como paso previo al Western Blot.



y varios protocolos mas ue se iran publicando conforme pueda.

Obtencion de suero

Obtencion de suero de sangre completa para la recuperacion de anticuerpos.

1). Obtenga una muestra de sangre completa en un tubo de vidrio
2). Incube a 37 oC durate 1 h, hasta que la sangre este bien coagulada
3). Refrigerar la muestra a 4 oC durante 12-16 h para permitir que el coagulo sanguineo se retraiga
4). Utilizando una pipeta pastur, retire cuidadosamente el coagulo y apoyandolo en la pared del tubo. Es imporante no lisar los eritrocitos del coagulo.
5). Centrifugar el suero a 4000 rpm durante 20 min a 4 oC.
6). Etiquetar y conservar el sobrenadante a -20 oC.
Nota: Para ciertos calculos es indispensable anotar el volume total de sangre y el volumen final de suero.

Medicion del tiempo de sangrado

Medicion del tiempo de sangrado

Aunque esta tecnica ya practicamente se ha dejado se usar debido a la llegada de nuevos y mejores metodos, todavia tiene utlidad, ver: "Idiopathic Thrombocytopenic Purpura: A practice Guideline Developed by Explicit Methods for the American Society of Hematology"

Protocolo 1

1). Anestesie al raton.
2). Haga una pequeña insicion en la vena dorsal de la cola usando la punta del bisturi.
3). Sumerja la cola en NaCl 0.9% a 37.5 oC
4). Mida con un cronometro el tiempo desde el incio del sangrado hasta la sangre deje de fluir espontaneamente

Protocolo 2

1). Anestecie al raton
2). Haga una pequeña inscion en la vena dorsal de la cola usando la punta del bisturi.
3). Aplique cada 15 seg una tira de papel (Whatman 3MM) durante 5 seg hasta que la sangre deje de fluir lo que se aprecia por que ya no se tiñe la tira.

Referencia

Carl W; Jackson et al. Consequences of GATA-1 deficiency in megakaryocytes and platelets. Blood 1999;93:2867-2875.

Sopa de cebolla

Sopa de cebolla segun una receta Zacatecana

En una cazuela grande preferentemente de barro (evite el que esta vidriado porque desprende plomo)
1). 3 cucharadas soperas de mantequilla (puede substituirse por margarina ICBI)
2). 2 cucaradas soperas de aceite de oliva.
3). Incubar con la llama de fuego en baja
4). Añadir de 1 a 1.5 kg de cebollas (de la region de Loreto, Zacatecas) cortadas en tiras muy delgadas
5). Incrementar la temperatura con la llama a fuego medio e incubar durante 20 a 30 minutos (con la cazuela tapada) o hasta que esten transparantes (como un gel de agarosa a muy baja concentracion, o menor).
6). Añada una chucharada cafetera de azucar morena (de ingenios tamaulipecos)
7). Añada una cucharada sopera del polisacarido marca Maizena
8). Aumente la llama del fuego a lo mas alto e incubelas por unos 10 minutos mas y de tanto en tanto saltealas (tomaran una coloracion ambar tendiendo al obscuro)
9). Añada dos tazas de caldo de res (o de pollo segun su preferencia, los de cubito van bien)
10). Mezclar bien (nosotros usamos una palita de madera michoacana)
11). Añada 4-5 tazas mas de la solucion señalada en el punto No. 8
12). Añada 500 mL de vino blanco (alguien me comento que el rosado tambien funciona pero nosotros no lo hemos ensayado, de preferencia de la region de calafia, Mexico)
13). Incube a fuego alto por unos 30-40 min. mas (se trata de concentrar la solucion caldosa)
14). Añada unos gramos de sal y pimienta negra al gusto (esta ultima molida al momento de añadirese)
15). Dore varias rebanadas de pan bolillo en margarina (en corte diagonal se ven mas bonitas) y coloquelas en el fondo de un tazon (cualquiere es bueno, por los de barro se ven mas bonitos).
16). Vierta la mezcla de cebollas junto con el caldo
17). Coloque una generosa cantidad de queso rallado fresco (zacatecano) o estilo chihuahua (nosotros se los compramos a los menonitas de Miguel Auza, Zacatecas) o de perdis manchego.
18). Consumase lo antes posible y bien caliente, acompañelas con el resto del vino blanco.

Nota 1:. Tanto la mezcla de cebolla como de vino contienen agentes antioxidantes.
Nota 2: La sopa de cebolla no sabe a cebolla fresca (por aquello de que algunos no nos gusta la cebolla cruda).

Determinacion de fosfato total

Determinacion de fosfato total

En tubo de esayo de vidrio borosilicado con tapa de rosca.

1). Prepare la curva estandar con fosfato de sodio en las siguientes concentraciones (uM): 0, 2, 5, 7, 10, 20, 40, 60, y 80 uM.

2). Deshidrate las muestras y los estandares con nitrogeno gaseoso en un evaporador.

3). 150 uL de acido perclorico al 70%.

4). Incube las muestras y estandares a 180 oC durante la noche o si los bloques son precalentados el tiempo de incubacion se puede reducir a 2 h.

5). Enjuage las paredes del tubo con 830 uL de agua ultrapura

6). Vortex7). 170 uL de molibdato de sodio al 2.5% (p/v)8). Vorex

9). 170 uL de acido ascorbico al 10% (p/v), preparese en fresco antes de usar.

10). Vortex.

11). Incubar a 50 oC durante 15 min.

12). Incubar a 22 oC durante 10 min.

13). Leer la absorbancia a 820 nm.

Determinacion de glucosaminos

En tubo de vidrio borosilicato con tapa de rosca.

1). 100 uL de muestra (la sensibilidad es de unos 0.5 - 10 µg GlcN).

2). 500 uL de HCl 2N

3). Burbuje la solucion con nitrogeno gaseoso

4). Cierre firmemente la tapa del tubo e incube a 100 oC durante 16 horas (use un baño seco, nosotros usamos el de Kit-Lab. El Paso, Texas, USA)

5). Para preparar la curva estandar use glucosaminos en la concentracion de 0 - 20 µg GlcN de una solucion stock de 1.5 mg/mL. (Use 0, 3, 5, 8, 10, 12 uL de la solucion stock y añada agua para aforar a 300 µL. Despues añada 300 µL de HCl 4N para obtener un volumen final de 600 uL y una concentracion de HCL de 2N). Las soluciones de la curva estandard no necesitan de hidrolisis.

6). Una vez finalizada la hidrolisis, tanto a las muestra como a los estandares se le añade 400 uL de Na2CO3 2M (10.6 g en 50 mL con pH - 7 con un ligero exceso de Na2CO3)

7). Agite suavemente

8). Añada 500 uL de acetil-acetona (preparar en fresco) al 2% en Na2CO3 1.5M (15.9 g carbonato de sodio + 2 mL de acetil acetona y agua para aforar a 100 mL).

9). Cierre el tubo firmemente en incube a 100 oC durante 20 min.

10). Enfriar en agua con hielo

11). 1000 uL de etanol

12). 500 uL ml del reactivo de Ehrlich (1 g de p-dimetilaminobenzaldehido en 15 mL de EtOH y 15 mL HCl conc.)

13). Agite en vortex para expeler el exceso de CO2

14). Se formara una coloracion en unos 5 min, y este cromoforo es estable por 1-2 horas.

15). Lea la absorbancia a 530 nm.

NOTA: NaCl afecta e desarrollo del color, es por ello que TODAS muestras y estandares tengan la misma concentracion de sal con el proposito de evitar variaciones en la coloracion. La dialisis ayuda a remover el NaCl pero consume mas tiempo y reactivos, vease DIALISIS.

Determinacion de carbohidratos totales

En tubo de ensayo de vidrio borosilicato

1). 10 uL - 50 µL de muestra
2). 19 uL - 95 µL de agua bidestilada
3). 10 uL - 50 µL de fenol al 80% (80% de fenol en peso disuelto en agua)
4). Vortex.
5). 400 uL - 2000 µL de acido sulfurico concentrado.
6). Incubar a 22 ºC durante 10 min.
7). Transferir 150 µL a un pozo de una microplaca de 96 pozos
8). Leer la absorbancia a 490nm en el lector de ELISA.
9). Curva de calibracion: Glucosa 1 mg/mL, usar: 0,10, 20, 40, 60 80 y 100 µL y aforara con agua bidestilada a 100 µL

Referencia

Dubois M, Giles K, Hamilton JK, Rebes PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and relatessubstances. Anal Chem 1956;28:350-356.

Determinación de proteínas (Bradford)

La medición de las proteínas totales se basa en el método descrito por Marion Bardford (cita)

1). Muestra:
Plasma: 2 o 5 uL, aforar a 50 uL con agua bidestilada
Orina, saliva o LCR: 10 o 20 uL aforar a 50 uL con agua bidestilada
2). Curva de calibración: Albúmina bovina serica (BSA), 1 mg / mL.: 0, 2, 4, 8, 10, 15, y 20 uL
3). Buffer o Agua bidestilada (milli Q): 50, 48, 46, 42, 40, 35, y 30 uL
4). Reactivo de Bradford: 200 uL
5). Agitar suvamente (en agitador robital)
6). Incubar a 22 oC durante 5 min.
7). Leer la microplaca en un lector de microplacas a 595 nm.

Determinacion de nitrito/nitrato (Griess)

Determinación de óxido nítrico

La medición de los nitritos totales (NO2-) se basa en la reacción de Griess (cita)

1). Muestra: plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, etc. (Previamente desproteinizados): 10, 20 o 50 uL
2). Agua bidestilada o milli-Q: 40, 30 o 0 uL
3). Curva de calibración: NaNO2, 100 uM.: 0, 2, 4, 8, 15, 30 y 50 uL
4). Agua bidestilada (milli Q): 50, 48, 46, 35, 20, y 0 uL
5). Sulfanilamida (Sigma) al 1%: 100 uL
6). Agitar suavamente (en agitador robital)
7). Incubar a 22 oC durante 15 min en oscuridad
8). N-naftilendiamina dihidroclorada (NED, Sigma) 0.1%: 100 uL
9). Agitar suavemente (en agitador orbital)
10). Incubar a 22 oC durante 15 min. en oscuridad
11). Leer la microplaca en un lector de microplacas a 540 nm.